765.隱蔽、狡猾、善變

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放療rt是肺癌必不可少的治療方式。對于不適合手術的iiia和iiib期肺癌患者，根治性放化療是治療標準，這一點已被廣泛接受。不幸的是，放療后腫瘤的再生長是成功控制疾病的主要障礙。

臨床前研究表明，放療對原發部位和轉移部位的腫瘤免疫微環境具有雙重作用。一方面，局部照射有可能激活針對遠離照射區域的腫瘤細胞的全身免疫反應，即遠隔效應，由ole在1953年首次報道。rt促進腫瘤抗原從垂死的腫瘤細胞中釋放，上調hci類表達，并增加多種細胞因子和免疫效應分子的表達，包括白細胞介素il1、細胞間粘附分子1ica1和血管細胞粘附分子1vca1，所有這些都有助于由輻射引發的持久和全身抗腫瘤免疫。另一方面，放療促進了腫瘤細胞的免疫逃避。例如，rt上調多種免疫抑制細胞因子的表達，如腫瘤壞死因子αtnfα、il6、il10和轉化生長因子βtgfβ。rt促進免疫抑制細胞的積累，例如腫瘤相關巨噬細胞ta細胞和髓源性抑制細胞dsc。輻射增強免疫檢查點的活性，如程序性細胞死亡蛋白1d1dl1、細胞毒性t淋巴細胞相關蛋白4ct4、t細胞免疫球蛋白和含粘蛋白結構域的蛋白3ti3。

為了克服放療的免疫抑制作用，已經提出并測試了免疫療法和放療的各種組合。在acific研究中，標準放化療后加入durvaab可延長iii期nsclc患者的無進展生存期和總生存期。acific研究的巨大成功不僅改變了iii期非小細胞肺癌的臨床指南，也引起了其他免疫療法與rt結合的極大興趣。

y抑制dscs的積累和浸潤，而較低劑量的照射往往會促進dscs募集到腫瘤中。此外，臨床前和臨床研究表明，胃腸道腫瘤，包括結直腸癌和肝癌，在放療后相對容易出現dscs水平降低，而在其他腫瘤模型和臨床環境中，如膠質瘤、肺癌、乳腺癌、頭頸部鱗癌、前列腺癌和宮頸癌，導致dsc數量持續增加。蔡等人首次報道dscs的dl1表達被輻照上調。然而，關于dscs的確切作用，尤其是其潛在機制，在輻照后塑造t方面知之甚少。

dscs是一組具有強大免疫抑制能力的異質髓細胞。根據表型和形態，dscs又可分為多形核dscsndscs，又稱粒細胞型dscs和單核型dscsdscs。

免疫抑制活性是1和吲哚胺2，3雙加氧酶ido的表達，以及一氧化氮no和活性氧ros的產生。這些不同的機制不會同時起作用。人們普遍認為ndscs和dscs通過不同的機制調控t。此外，dl1的上調也被認為是輻射招募dscs的免疫抑制機制之一。目前，對于輻照誘導的dscs對t的影響及放療的治療效果尚無一致的結論。

磷酸二酯酶5de5抑制劑，如西地那非和他達拉非，可以阻斷環磷酸鳥苷cg1的活性和表達來促進抗腫瘤免疫。然而，de5抑制劑如何影響dsc的亞群以及rt和de5抑制劑的組合是否會延遲輻射后的腫瘤再生尚未得到測試。

我們最近的研究表明，消除招募的dsc會延遲放療后路易斯肺癌llc的再生。在這里，我們報告了局部照射通過促進1的上調和激活是照射后1過表達和ndsc募集消除了輻射衍生的免疫抑制。

在tb小鼠和癌癥患者中，dscs隨著腫瘤的生長而擴增。dscs的兩個亞群之間的比例取決于特定的腫瘤模型和微環境。為了監測同源llc模型中dsc的豐度，我們通過免疫表型分析確定了接種后腫瘤的生長以及llc小鼠中不同時間點的總體dsc及其亞群。

如圖1c所示，腫瘤組織中總dscs的百分比隨著腫瘤的發展而穩步增加，從接種后第一周腫瘤浸潤淋巴細胞的不到10（584±122）上升到第四周超過20（2171±322）（alt001）。在我們的llc模型中，ndscs占總dscs的9494±847，并且與總dscs具有相同的腫瘤發展趨勢（alt005）。對亞群進行分析，雖然dscs增加了大約5倍，但差異沒有統計學意義。

為了更好地了解dscs的全身分布，我們還研究了dscs在外周血、脾臟和骨髓中的比例。僅在接種llc細胞一周后，tb小鼠外周血中的dsc百分比是無瘤小鼠的兩倍2733±462vs1248±093，alt005，3周后的dsc百分比是無瘤小鼠的5倍2733±462vs1248±093，alt005。tb小鼠外周血中ndscs的比例也增加，而dscs的比例與腫瘤大小無關。

dl1是腫瘤細胞、dscs、巨噬細胞和樹突狀細胞表達的最重要的檢查點分子之一。為了確定tb小鼠dscs的dl1表達是否與健康小鼠不同，我們通過流式細胞術測試了dscs的dl1表達。結果表明，t中dscs上dl1的平均熒光強度（fi）從在llc細胞接種后的第一周3868±1009au逐漸增加到第四周的1，0680±1218au（alt001），這表明dl1在我們模型中的dsc中具有潛在作用。

在脾臟和骨髓中，隨著腫瘤的發展，dscs的比例也顯著增加，其模式與腫瘤組織和外周血中的dscs相同。此外，我們在tb小鼠中觀察到明顯的脾腫大，這與我們觀察到的dscs在脾內聚集一致。

為了確定局部照射對腫瘤生長和yf治療皮下llc腫瘤。放療導致腫瘤進展延遲長達一周，在第7至第10天的最小體積約為5003，但此后腫瘤開始再生。根據放療前后腫瘤生長曲線，我們選擇放療后第3天為再生前生長，放療后1周為腫瘤體積最小時為再生開始，放療后2周和3周為再生階段。腫瘤組織蘇木精伊紅染色顯示，與未治療的腫瘤相比，放療后的腫瘤中有更多的浸潤性炎癥細胞。隨后的cd11b特異性免疫組化染色顯示，大多數炎癥細胞是cd11b髓系細胞，這表明局部照射可能導致dscs的積累。為了證實我們的假設，我們在局部照射后的不同時間點對總dscs和這兩個亞群進行了流式細胞術分析。局部照射后，放療后腫瘤浸潤dscs的比例比未治療腫瘤高2倍ctrlvsrt2133±329vs4410±300，alt0001。ndscs與總dscs具有相同的增加趨勢ctrlvsrt1637±247vs3866±424，alt0001，而dsc比例保持在約01，且與腫瘤大小和治療無關。外周血情況同腫瘤組織。八77

為了確定受照射腫瘤中單克隆抗體來消耗抗體的應用顯著降低了腫瘤部位和外周血中抗體治療大大延遲了照射后的再生，這表明ndsc的募集對腫瘤再生至關重要。

雖然ndscs利用一系列機制來抑制抗腫瘤免疫反應，這涉及到許多免疫細胞和細胞因子，但對cd8t細胞的抑制無疑是最重要的。為了確定rt后ndscs誘導的免疫抑制是否依賴于cd8t細胞，我們通過流式細胞術評估了cd8t細胞的數量和功能。

如圖3d所示，cd8t細胞的百分比隨著照射從1171±231下降到242±062a抗體242±062vs2012±392，alt001）。為了更好地了解cd8t細胞浸潤腫瘤部位的功能狀態，我們測量了cd8t細胞內部和表面上ifnγ、cd28和d1的表達。局部rt顯著降低了cd8t細胞分泌ifnγ的比例，從3306453降至1325208，并增加了表達d1的cd8t細胞的比例（ctrlvsrt25320±5703auvs53880±9876）au，alt005）。

cd28表達未觀察到顯著變化。當抗ly6g抗體被給予輻照小鼠時，ifnγ分泌達到與未處理的llc小鼠相同的水平（2974±355），而與輻照小鼠進行比較抗ly6g抗體處理后的d1表達沒有變化小鼠。因此，在這部分我們建議ndscs通過抑制cd8t細胞促進放療后腫瘤的再生。ndscs不僅抑制了t中cd8t細胞的數量，而且還抑制了其活性。

為了確定輻照誘導1的表達，但沒有增強os的表達。arg1活性測定表明，局部照射顯著提高了arg1的活性，從040015ul提高到378039ulalt001。相比之下，no熒光標記的os活性檢測顯示，輻照和未處理的腫瘤組織樣本的熒光強度相似。

dl1的表達是dscs的一種新型免疫抑制機制。然后我們詢問dl1上調是否是rt后dscs介導的免疫抑制的機制之一。通過流式細胞術分析輻照后dsc中dl1的表達。圖4e顯示，與未處理組相比，受照射腫瘤的dsc中的dl1表達在照射后不久顯著增加（照射后第三天ctrlvsrt4439±1753auvs13280±3243au，alt005）然而，此后dl1表達繼續下降，局部照射組在照射后第3周顯著低于未治療組（ctrlvsrt1，4650±3996auvs4075±1648au，alt005）。外周血中dscs的dl1表達與局部腫瘤部位的表達趨勢相同。

以上數據表明arg1表達的上調是照射后n1抑制劑nornoha。101活性從378039ul降低到202025ul（alt001）。

rt后給予nornoha顯著增加cd8t細胞比例（rtvsrtnornoha242062vs614064，alt001），并伴有腫瘤再生延遲。os抑制劑1400對腫瘤再生長沒有影響。

我們的結果表明，rt通過上調腫瘤內1活性可能是一種新的抗腫瘤策略是合理的。越來越多的證據表明，de5抑制劑可以抑制tb小鼠和癌癥患者d，以研究它是否可以促進rt的抗腫瘤作用并闡明潛在機制。如圖5b所示，正如我們預期的那樣，西地那非延遲了照射后的腫瘤再生長，這與陽性對照nornoha相當。t的免疫特征表明，當給予西地那非時，腫瘤內ndsc的比例從3866±424下降到2357±238。

此外，西地那非也顯著降低了arg1的表達。為了進一步檢查西地那非對dsc的抑制是否真的導致抗腫瘤免疫增強，我們分析了腫瘤內cd8t細胞的比例和活性。流式細胞術分析表明cd8t細胞的百分比從242±062增加到721±122。

此外，當給予西地那非時，cd8t細胞分泌的ifnγ也顯著升高。因此，我們證實de5抑制劑西地那非通過調節ndscs改善了照射后腫瘤免疫微環境。西地那非聯合放療可能是提高放療療效的一種有前景的策略。

工作揭示了1通路介導rt后腫瘤再生的新機制，如圖6所示。我們認為，1的上調和激活是ndscs在放療后抑制cd8t細胞的主要機制。為了克服ndscs引起的免疫抑制，我們提出并證明，sildenafil和rt聯合使用降低了ndscs在t內的募集和免疫抑制作用，激活了cd8t細胞應答，導致腫瘤生長延遲。綜上所述，我們的研究結果為緩解免疫抑制t以提高rt治療效果了一種新的解決方案。雖然所有這些結果都是在llc小鼠模型中進行的，但同樣的機制是否適用于其他腫瘤模型尚不清楚。此外，在不同的輻射方案下，dscs及其亞型如何影響t仍未確定。因此，這些問題還需要進一步的研究來解決。

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